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Western Blot常見問題及注意事項(xiàng)

WB常見問題常見問題解決對(duì)策及注意事項(xiàng)兩快玻璃板之間灌膠,膠總是不平玻璃沒有洗干凈，應(yīng)該要洗得非常干凈過硫酸銨和TEMED的加量不合適，加量相對(duì)較多，凝膠凝固過快，也會(huì)造成膠不平現(xiàn)象加完試劑以后沒有很好的搖勻，導(dǎo)致有些部位的聚合劑濃度過高，聚合相對(duì)較快造成膠不平膠總是漏避免玻璃邊緣（與膠條接觸處）破損膠條一定要干，跑完電泳后，膠條就放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上晾著。下面的膠條注意不要老化，如果有裂紋的話用保鮮膜墊在上面，也可以有效防止漏膠將兩塊玻板擺放*對(duì)齊，底部處于同一個(gè)平面膜上有明顯氣泡...

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蛋白印跡用緩沖液及洗滌液

轉(zhuǎn)印緩沖液提供了電極之間的電連續(xù)性，其必須是導(dǎo)電的。它還提供了一個(gè)化學(xué)環(huán)境，能維持蛋白質(zhì)的溶解度，又不妨礙轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)吸附到膜上。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)印緩沖液包含緩沖系統(tǒng)和甲醇。Tris甘氨酸緩沖液，常用于槽轉(zhuǎn)印系統(tǒng)中。這種緩沖液的pH值為8.3，比大多數(shù)蛋白的等電點(diǎn)（pI）要高。在凝膠上分離的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，向陽(yáng)極遷移。由于槽內(nèi)的緩沖液是混合的，故轉(zhuǎn)移過程中的離子分布保持相對(duì)恒定。在蛋白測(cè)序應(yīng)用中，建議使用10mMCAPS緩沖液（pH=11）。凝膠電泳緩沖液中殘留的甘氨酸導(dǎo)致蛋白測(cè)...

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尼龍膜、PVDF膜、NC膜區(qū)別

轉(zhuǎn)印膜：用于蛋白質(zhì)和核酸的轉(zhuǎn)移和檢驗(yàn)過程的微孔膜。Southernblot：又稱Southern印跡雜交，是研究DNA圖譜的基本技術(shù)。Northernblot：又稱Northern印跡雜交，是檢測(cè)RNA的基本技術(shù)。Westernblot：又稱Western印跡雜交，是蛋白質(zhì)檢測(cè)分析的基本技術(shù)。轉(zhuǎn)印膜在蛋白質(zhì)和核酸的轉(zhuǎn)移和檢測(cè)過程中應(yīng)用廣泛，不同的轉(zhuǎn)印膜規(guī)格和參數(shù)不同，選擇正確、均一穩(wěn)定的轉(zhuǎn)印膜對(duì)達(dá)到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果起到關(guān)鍵性的作用。常用的三種轉(zhuǎn)印膜：硝酸纖維素膜（NC膜）、帶正電的...

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實(shí)驗(yàn)室詳解單克隆抗體的制備過程

單克隆技術(shù)又名雜交瘤技術(shù)。由G.K?hler和Milstein1975年創(chuàng)立。主要原理是利用產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞雜交融合成雜交瘤細(xì)胞，生產(chǎn)抗體。單克隆抗體的制備過程主要有以下六個(gè)環(huán)節(jié)，具體為抗原指標(biāo)、免疫動(dòng)物選擇、免疫程序的確定、免疫、細(xì)胞雜交與選擇培養(yǎng)。單抗制備步驟1、抗原制備制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說(shuō)雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機(jī)會(huì)增加，同時(shí)可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純?cè)胶茫瑧?yīng)根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件來(lái)決定。2、免疫動(dòng)物...

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Western/ELISA顯色底物大盤點(diǎn)

一、HRP辣根過氧化酶是常見的酶促發(fā)光或顯色的交聯(lián)酶，由于HRP比活高、特異性更強(qiáng)、分子量?。?0kD）、穩(wěn)定性好和作用底物范圍廣的優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛使用。HRP的底物種類有不少，主要可以分為化學(xué)發(fā)光底物和生色底物2大類:1.化學(xué)發(fā)光底物：化學(xué)發(fā)光底物主要考慮的是：發(fā)光信號(hào)強(qiáng)弱——發(fā)光信號(hào)當(dāng)然越強(qiáng)越好，強(qiáng)發(fā)光信號(hào)持續(xù)的時(shí)間也是越長(zhǎng)越好，還有就是背景低靈敏度高。原理：試劑中的發(fā)光物在辣根過氧化物酶的作用下發(fā)生氧化降解，并發(fā)射波長(zhǎng)為428nm的光，此光可經(jīng)x光膠片(放射自顯影片)感光...

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CTAB作用原理

物理性狀呈白色或淺黃色結(jié)晶體粉末狀，有刺激氣味，易溶于異丙醇，可溶于水，震蕩時(shí)產(chǎn)生大量泡沫。能與陰離子、非離子、兩性表面活性劑有良好的配位性。具有優(yōu)良的滲透、柔化、乳化、抗靜電、生物降解性及殺菌等性能。作用原理CTAB是一種陽(yáng)離子去污劑,可溶解細(xì)胞膜,具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性。它能與核酸形成復(fù)合物：在高鹽溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的,當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3mol/LNaCl）時(shí),從溶液中沉淀,通過離心就可將CTAB-核酸的復(fù)...

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二甲基亞砜配制及作用

二甲基亞砜物理性質(zhì)二甲基亞砜，英文名稱DMSO。無(wú)色粘稠液體。有吸濕性。能與水、乙醇、丙酮、乙醛、吡啶、乙酸乙酯、苯二甲酸二丁酯、二惡烷和芳烴化合物等任意互溶，不溶于乙炔以外的脂肪烴類化合物。二甲基亞砜用途廣泛，可用作溶液和反應(yīng)試劑。DMSO在有機(jī)合成，醫(yī)藥、電子等方面均有應(yīng)用。二甲基亞砜的合成二甲基亞砜一般采用二甲硫醚氧化法制得，由于所用的氧化劑和氧化方式不同，因而有不同的生產(chǎn)工藝。甲醇二硫化碳法甲醇和二硫化碳為原料，以γ-Al2O3作催化劑，先合成二甲基硫醚，再與二氧化氮...

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紅細(xì)胞裂解液的工作原理及配制方法

紅細(xì)胞裂解液裂解是一種比較溫和的紅細(xì)胞去除方法，它能既不損傷有核細(xì)胞又能充分的去除紅細(xì)胞。那么紅細(xì)胞裂解液的原理是怎么樣的呢？裂解液作用原理血紅細(xì)胞表面上有紅細(xì)胞專屬的表面抗原，當(dāng)裂解液中含可以攻擊特定紅細(xì)胞表面抗原的酶的時(shí)候就只會(huì)造成紅細(xì)胞的變形，生物通道擴(kuò)大膨脹裂解，或者引起紅細(xì)胞的變形，而不會(huì)攻擊其他細(xì)胞；另外紅細(xì)胞有自己的電負(fù)性，滲透脆性（通常是一些非酶細(xì)胞裂解液的突破點(diǎn)），懸浮穩(wěn)定性，這都是區(qū)別于其他種類細(xì)胞的區(qū)別點(diǎn)。紅細(xì)胞裂解液就是利用這些特性裂解紅細(xì)胞的。另外紅...

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